El değmeden hazırlanmış (HASTALIK) mı besinlerimiz? (IŞIL İŞLEM GÖRMÜŞ GIDALARIMIZ ÜZERİNE) Araştırma Yayın Makalesi başlığı: İşlenmiş gıdalar bağırsak bariyeri geçirgenliğini ve mikrovasküler hastalıkları tetikler. . Bu kez yayınlayacağımız bilimsel makaleyi daha önce yaptığımız gibi hepimizin anlayacağı şekilde bilimsel ve teknik terimler ve detaylardan özellikle arındırmadan orijinal yayınına sadık kalarak yapacağım. Not makale içindeki şekil ve örnek numaraları da sıralı ve açıklamalı olarak görsellere bilgi halinde eklenmiş olarak bulabilirsiniz. Gerçekten hayret edilecek bilgiler ve bulgular. Mehmet Ural #ferrocan #KültürveMerak . İşlenmiş gıdalar bağırsak bariyeri geçirgenliğini ve mikrovasküler hastalıkları tetikler . Soyut bilgi: İşlenmiş gıdaların alımı, kronik böbrek hastalığı (KBH) ve diyabet gibi mikrovasküler hastalıkların artmasıyla aynı zamana denk gelecek şekilde, son on yılda önemli ölçüde artmıştır. Burada, kemirgen modellerinde, işlenmiş bir diyetin uzun süreli tüketiminin bağırsak bariyeri geçirgenliğini ve CKD riskini artırdığını gösteriyoruz. Isıl işlemden sonra gıdalarda Maillard reaksiyon ürünleri üreten gelişmiş glikasyon yolunun inhibisyonu, böbrek hasarını tersine çevirdi. Sonuç olarak, işlenmiş bir diyet, doğuştan gelen immün kompleman aktivasyonuna ve güçlü proinflamatuar efektör molekül kompleman 5a (C5a) yoluyla lokal böbrek iltihabına ve hasarına yol açar. Bir fare diyabet modelinde, yüksek dirençli bir nişasta lifi diyeti, bağırsak bariyer bütünlüğünü korudu ve komplemanın baskılanması yoluyla böbrek hasarının şiddetini azalttı. . GİRİŞ İşlenmiş gıdalar, Batı diyetinin önemli bir özelliğidir. Artık işlenmiş gıdaların insan sağlığına zararlı olduğuna dair artan sayıda kanıt var ( 1 ). İşlenmiş, ısıl işlem görmüş gıdaların mevcudiyeti ve tüketimi , obezite ve diyabet pandemisine paralel olarak geçtiğimiz on yıllarda ( 2 ) önemli ölçüde artmıştır ( 3 , 4 ). Obezite ve diyabet mikrovasküler komplikasyonlar, özellikle kronik böbrek hastalığı (KBH) ile ilişkilidir. KBH genel popülasyonun neredeyse %14'ünü etkiler ( 5 ) ve kendisi kardiyovasküler hastalık ve tüm nedenlere bağlı ölümler için önemli bir risk faktörüdür ( 6 ). . İşlenmiş gıdaların giderek daha fazla tanınan ve potansiyel olarak patojenik bir bileşeni, gelişmiş glikasyon son ürünleri (AGE'ler) olarak bilinen bir grup translasyon sonrası modifikasyondur. AGE'ler amino asitlerin ve indirgen şekerlerin karışımlarından, genellikle gıda üretimi ve işlenmesi sırasında meydana gelen ısıl işlem sırasında olduğu gibi ısı koşulları altında gerçekleşen Maillard reaksiyonu ( 7 ) yoluyla üretilir ( 8 – 10 ). Maillard reaksiyonu gıdalarda tat ve aroma veren kimyasal değişikliklere neden olduğu için ( 11).), gıda endüstrisi, duyusal özellikleri ve lezzeti artırmak için gıdalardaki Maillard reaksiyon ürünlerini uzun süredir geliştirdi veya takviye etti ve bu nedenle, AGE'ler işlenmiş (ve özellikle yoğun şekilde ısıl işlem görmüş) gıdaların her yerde bulunan bir bileşenidir. Bu AGE'leri içeren işlenmiş gıdaların tüketimi, kronik hastalık riskinin temelini oluşturabilir ( 8 ). . Diyetten türetilen AGE'lerin çoğu, sindirim ve emilimden kaçar ve gastrointestinal sistemden kolona geçer ( 12 , 13 ). Burada, bağırsak mikrobiyal metabolizması için substratlar olarak mevcutturlar ( 14 , 15 ). Bununla birlikte, uzun süreli işlenmiş gıda alımının bağırsak geçirgenliğini ne ölçüde etkilediği ve KBH gibi mikrovasküler bozuklukların sonucunu ne ölçüde etkilediği belirsizdir. İşlenmiş gıdaların tüketimi kanser ( 16 ), kardiyovasküler hastalıklar ( 17 , 18 ) ve tüm nedenlere bağlı ölümler ( 18) ile ilişkilendirilmiştir.); bu nedenle, işlenmiş gıdaların kronik alımını bulaşıcı olmayan hastalıkların başlangıcına ve ilerlemesine bağlayan moleküler mekanizmaların tanımlanmasına acil bir ihtiyaç vardır. . SONUÇLAR İşlenmiş bir diyet, doğuştan gelen bağışıklık tamamlayıcı aktivasyonu ile ilişkili CKD'yi indükler İşlenmiş diyetlerin mikrovasküler hastalık riski üzerindeki etkisini incelemek için Sprague-Dawley sıçanlarına 24 hafta boyunca termal olarak işlenmiş bir diyet verdik. Termal işlemin gıda maddelerindeki de novo AGE içeriğini arttırdığı iyi belgelenmiştir ( 8 ) ve pişmemiş bir kemirgen yemeğinin (AIN93G; tablo S1) 60 dakika boyunca ısıl işlemi, iyi tanımlanmış AGEs N ε- karboksimetil lizinde bir artışa yol açar ( KML), N ε-karboksietil lizin (CEL) ve fruktozamin (tablo S2), ısıya dayanıklı vitaminleri (tablo S2) yok etmez. Diyetler, ad libitum olarak sağlandı ve artan yiyecek tüketimine veya kalori alımına yol açmadı (tablo S3). Isıl işlem görmüş (HT) diyetin kronik tüketimi, böbrek hasarı ile tutarlı olarak, pişmemiş kontrol (Con) diyeti ( Şekil 1A ) ile görülenden beş kat daha fazla albüminin idrara sızmasına neden oldu. Isıl işlem görmüş diyetin tüketilmesi, artan kreatinin klirensi [glomerüler filtrasyon hızının (GFR) bir vekil göstergesi); 1B] ve böbreklerin glomerüllerinde morfolojik değişiklikler, kan filtrasyonunda yer alan bir kılcal damar kümesi {glomerüloskleroz [glomerülosklerotik indeks (GSI)]; Şekil 1C }. Tubulointerstisyel fibroz, ilerleyici KBH'nin belirgin bir özelliğidir. Isıl işlem görmüş diyet , tübüler interstisyel boşluk içinde hücre dışı matris bileşenlerinin birikmesiyle tutarlı olarak tübülointerstisyel genişlemede bir artışa yol açtı ( Şekil İD ). Transforme edici büyüme faktörü-β1 (TGF-β1), CKD'de renal fibrozisin tetiklenmesinde çok önemlidir ( 19 ) ve ısıl işlem görmüş diyetin kronik tüketimi ile renal kortekste TGF-β1 aktivasyonu gözlemlenmiştir ( Şekil 1E ). vasküler endotelyal büyüme faktöründeki artışa paralel olarak (VEGF; Şekil 1F)), mikrovasküler mimarideki bozulma ile tutarlı bir anjiyojenik sitokin. CKD ortamında reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretiminin renal fibrozise yol açan kronik inflamatuar süreçlerin altında yattığı düşünülmektedir ( 20 ). Isıl işlem görmüş diyeti yiyen sıçanlar , ROS oluşumunun önemli bir bölgesi olan 3-nitrotirozin eklentilerinin ( Şekil 1G ) ve mitokondriyal süperoksit oluşumunun ( Şekil 1H ) oluşumu ile böbreğe lokalize olan oksidatif stres tepkisinin kanıtını gösterdi . İnflamatuar kemokin monosit kemoatraktan protein-1 (MCP-1), yüksek AGE beslemesi ile artmıştır ( Şekil 1I ), bu da işlenmiş gıdanın "steril" bir inflamatuar yanıtı tetikleyebileceğini düşündürmektedir. . Isıl işlem görmüş diyetin kronik beslenmesinde gözlenen böbrek fenotipinden işlenmiş diyetin AGE bileşeninin sorumlu olup olmadığını araştırmak için, AGE yolunun bir inhibitörü olan alagebrium klorür (ALA) uyguladık. Isıl işlem görmüş diyetlerin patojenik etkilerinin AGE'lere bağlı olduğu hipoteziyle uyumlu olarak, ısıl işlem görmüş sıçanların ALA (günde 10 mg/kg) ile oral gavaj yoluyla farmakolojik tedavisinin böbrek hasarını azalttığını gözlemledik ( Şekil 1 , A ila D ve F ), renal fibroz ( Şekil 1E ), oksidatif stres tepkisi ( Şekil 1, G ve H ) ve sistemik inflamasyon ( Şekil 1 ). . Böbrek hastalığının ilerlemesine neden olabilecek ısıl işlem görmüş diyet kaynaklı sistemik faktörler hakkında fikir edinmek için sıçan serumu poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıldı. Protein bantlarının görselleştirilmesi, ısıl işlem görmüş diyet hayvanlarının serumunda benzersiz bir şekilde gözlemlenen yaklaşık 118 kDa'da bantların varlığını ortaya çıkardı ( Şekil 1J).). Bantların çıkarılması ve ardından matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-uçuş süresi (MALDI-TOF) kütle spektrometrisi (MS) tabanlı proteomik kullanılarak peptit kütle parmak izi alınması, bu benzersiz protein bantlarını tamamlayıcı bileşen C3 olarak tanımladı. Doğuştan gelen bağışıklık tamamlayıcı sistemi, istilacı patojenlere veya doku hasarına yanıt olarak aktive olan oldukça karmaşık bir protein ağıdır. Bu sistem hassas bir şekilde dengelenmiştir ve düzensizlik veya hiperaktivasyon durumlarına maruz kaldığında güçlü bir inflamatuar yanıt yayabilir. Tamamlayıcı dört mekanik yoldan oluşur: klasik, lektin, alternatif ve dışsal. Bunlardan herhangi birinin aktivasyonu, sırasıyla tamamlayıcı C3 ve C5'i parçalayan tamamlayıcı C3 ve C5 dönüştürücülerinin üretimine yakınsar,21 ). Tüm kompleman aktivasyon yolakları, C5aR1 reseptörü ile ligasyon yoluyla inflamatuar hastalık durumlarında patolojiyi başlatan ve yayan kompleman sisteminin güçlü ve ana efektör bir molekülü olan C5a'nın oluşumuyla sonuçlanır ( 22 ). Buna göre, ısıl işlem görmüş diyetin kompleman aktivasyonu üzerindeki etkilerini doğrulamak için, kaskadın distalindeki kompleman efektör moleküllerinin konsantrasyonlarını, C3a ( Şekil 1K ) ve C5a'yı ( Şekil 1L ) ölçtük .), her ikisi de ısıl işlem görmüş diyet alan sıçanların idrarında arttı ve özellikle C5a, AGE-düşürücü tedavi (ALA) ile zayıflatıldı, bu da AGE yolu yoluyla düzenlemeyi düşündürdü. C5a reseptörü C5aR1 için böbrek korteksinin immün boyaması, ağırlıklı olarak renal tübüllere ve glomerüllere lokalizasyon gösterdi, bu reseptörün bolluğu ısıl işlem görmüş diyetle arttı ( Şekil 1, M ve N ). Birlikte, bu veriler, işlenmiş diyetlerin kronik tüketiminin, diyetin AGE içeriğinin doğrudan bir sonucu olarak böbrek hasarına, profibrotik değişikliklere ve kompleman yolu aktivasyonuna yol açabileceğini göstermektedir. [caption id="attachment_229513" align="alignnone" width="1400"] ŞEKİL 1 İşlenmiş bir diyetin uzun süreli tüketimi, düşük dereceli sistemik inflamasyonu, kompleman aktivasyonunu ve CKD'yi destekler.Sağlıklı sıçanlar, tedavi edilmemiş bir diyet (Con; beyaz), işlenmiş bir ısıl işlem görmüş diyet (HT; kırmızı) veya ısıl işlem görmüş bir diyet artı AGE inhibitörü ALA (HT + ALA; mavi) (günde 10 mg/kg) ile beslendi. 24 hafta boyunca oral gavaj). ( A ve B ) Böbrek fonksiyonu. (A) Yirmi dört saatlik idrarla albümin atılımı. (? Kreatinin klirensi. ( C ve D ) Böbrek histolojisi. (C) Glomerülosklerotik indeks (GSI) ve temsili PAS lekeli böbrek bölümleri (sağda). Ölçek çubuğu, 50 um. (D) Renal tubulointerstisyel genişleme. ( E ve F ) Böbrek korteksi (E) aktif TGF-21 proteini ve (F) VEGF'de ölçülen prosklerotik sitokinler. ( G ve H) Renal kortikal oksidatif stres belirteçleri (G) 3-nitrotirozin ve (H) mitokondriyal süperoksit oluşumu. ( I ) MCP-1'in plazma seviyeleri. ( J ) Sıçan serumunun SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), ısıl işleme tabi tutulmuş diyetle beslenen sıçanlarda bulunan 118 kDa'lık bir proteinin varlığını gösterir. MALDI-TOF MS, bu proteini tamamlayıcı bileşen C3 olarak tanımladı. ( K ve L ) Distal kompleman proteinlerinin (K) C3a ve (L) C5a'nın idrarla atılımı. ( M ve N ) C5aR1 kantifikasyonu (M) ve lokalizasyon ? için böbrek korteksinin immün boyaması. Veriler ortalama ± SEM'dir. Noktalar bireysel kemirgenleri temsil eder. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P< 0.001 ve **** P < 0.0001. P değerleri, Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile belirlendi; n = grup başına 5 ila 10 sıçan.[/caption] . İşlenmiş diyete bağlı mikrovasküler yaralanma için tamamlayıcı anafilatoksin sinyali zorunludur. İşlenmiş bir diyetin tüketilmesinin bir sonucu olarak böbrek hasarının gelişmesi için C5a sinyalinin gerekli olup olmadığını belirlemek için, in vivo ısıl işleme tabi tutulmuş diyet modeli, günlük olarak oral olarak aktif olan bir fare grubu ilave edilerek 24 hafta boyunca tekrarlandı. C5aR1 inhibitörü, PMX53 ( 23 ), oral gavaj yoluyla günde 2 mg/kg. PMX53 uygulaması yoluyla C5a sinyalinin inhibisyonu, ısıl işleme tabi tutulmuş diyet kaynaklı albüminüriyi ( Şekil 2A ), renal hiperfiltrasyonu ( Şekil 2B ) ve azaltılmış GSI'yi ( Şekil 2, C ve D ) önledi . Aktif TGF-21 ( Şekil 2D ), mitokondriyal süperoksit üretimi ( Şekil 2F ) ve MCP-1'in ( Şekil 2G ) her biri farmakolojik C5aR1 inhibisyonu ile nemlendirilmiştir. [caption id="attachment_229514" align="alignnone" width="1400"] ŞEKİL 2 C5aR1 reseptörünün farmakolojik inhibisyonu, işlenmiş bir diyetin kronik tüketiminden kaynaklanan böbrek hasarını, düşük dereceli inflamasyonu ve ROS oluşumunu iyileştirir.Sağlıklı sıçanlar, 24 hafta boyunca C5aR1 antagonisti PMX53 (günde 2 mg/kg oral gavaj; gri) uygulanarak veya uygulanmadan kontrol (Con; beyaz) veya ısıl işlem görmüş (HT; kırmızı) diyetle beslendi. ( A ) Albüminin yirmi dört saatlik idrarla atılımı. ( B ) Kreatinin klirensi. ( C ) GSI ve ( D ) temsili PAS lekeli böbrek kesitleri. Ölçek çubuğu, 50 um. ( E ) Böbrekte aktif TGF-21 proteini. ( F ) Böbrek mitokondriyal süperoksit. ( G ) Plazma MCP-1. Veriler ortalama ± SEM'dir. Noktalar bireysel kemirgenleri temsil eder. * P < 0.05 ve ** P < 0.01. Pdeğerler, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA ile belirlendi; n = grup başına 5 ila 10 sıçan.[/caption] . C3'ün bölünmesi yoluyla üretilen C3a, tamamlayıcı kaskadı tarafından üretilen diğer anafilatoksindir. Isıl işlem görmüş bir diyetin kronik tüketiminden kaynaklanan böbrek hasarı için C3a aktivasyonunun gerekli olup olmadığını belirlemek için, C3a reseptörü eksikliği olan fareleri (C3aR −/− fareler) 24 hafta boyunca ısıl işlem görmüş bir diyetle besledik . C3aR'nin genetik olarak silinmesi, böbrek fonksiyonunda [kreatinin klirensi ( Şekil 3A )] ısıl işlem görmüş diyet kaynaklı değişiklikleri hafifletti , ancak albüminüriyi ( Şekil 3B ), yapısal hasarı (GSI; Şekil 3, C ve D ) veya fibrozisi değil (aktif TGF-21; Şekil 3E ). Tübüler yaralanmanın idrar belirteçleri (Kim-1; Şekil 3F ) ve oksidatif stres (15-izoprostan F 2t ; Şekil 3G)) ısıl işlem görmüş diyet tarafından indüklendi ve bu artış C3a reseptörünün silinmesiyle düzeldi. [caption id="attachment_229515" align="alignnone" width="1400"] ŞEKİL 3 C3aR'nin genetik olarak silinmesi, böbrek fonksiyonunu normalleştirir, ancak ısıl işlem görmüş bir diyete yanıt olarak yapısal hasarı değil.C3aR −/− (sarı) ve vahşi tip (mavi) fareler, 24 hafta boyunca pişmemiş (Kontrol) veya ısıl işlem görmüş bir diyetle beslendi. ( A ) Kreatinin klirensi. ( B ) Albüminin yirmi dört saatlik idrarla atılımı. ( C ) GSI ve ( D ) temsili PAS lekeli böbrek kesitleri. Ölçek çubuğu, 50 um. ( E ) Böbrekte aktif TGF-21 proteini. ( F ) İdrarda böbrek hasarı molekül-1 (Kim-1) atılımı. ( G ) İdrar 15-izoprostan F 2t . Veriler ortalama ± SEM'dir. Noktalar bireysel kemirgenleri temsil eder. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 ve **** P < 0.0001.P değerleri, Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü ANOVA ile belirlendi; n = grup başına 7 ila 10 fare.[/caption] . Bu veriler, işlenmiş bir diyetin kronik tüketiminin böbrek hasarını indüklediğine ve proinflamatuar efektör molekül C5a'nın blokajının bu değişiklikleri önlediğine dair daha fazla kanıt sağlar; bu da, ısıl işlem görmüş diyet kaynaklı böbrek fonksiyon bozukluğunun gelişiminde kompleman yolunun önemli rolünü gösterir. . İşlenmiş diyetler, bağırsak bariyeri geçirgenliğini ve bağırsak ortak konsorsiyumunun yeniden dağıtımını destekler. Artan bağırsak geçirgenliği, iltihaplanma ve kronik hastalık riskine yol açar ( 24 ). Bağırsak epitelyal sıkı bağlantı proteinleri tehlikeye girdiğinde, lipopolisakkarit (LPS) gibi mikrobiyal moleküller bağırsaktan sistemik dolaşıma geçer. Bakteriyel ürünler, doğuştan gelen bağışıklık sistemini tetikleyerek kronik iltihaplanmaya neden olur. İşlenmiş diyetlerin bağırsak geçirgenliğini artırıp artırmadığını araştırmak için, ısıl işlem görmüş diyeti tüketen sıçanların serumunda LPS seviyeleri belirlendi. 24 hafta boyunca ısıl işlem görmüş diyeti yiyen sıçanlarda serum LPS'si arttı, bu durum ya AGE inhibitörü alagebrium ( Şekil 4A ) ya da C5aR1 inhibitörü ( Şekil 4B ) ile tersine çevrildi .), bağırsak geçirgenliğindeki değişikliklerin işlenmiş gıdaların etkilerine dahil olduğunu ve tamamlayıcı sinyallemenin aracılık ettiğini öne sürüyor. . Diyet, bağırsak mikrobiyota çeşitliliği ve bolluğunun önemli bir belirleyicisidir ( 25 ). İşlenmiş diyet tüketiminin bağırsak mikrobiyota profili üzerindeki etkilerini incelemek için, C57BL/6 farelerine 24 hafta boyunca ısıl işlem görmüş bir diyet verildi ve çekal sindirime 16 S ribozomal RNA (rRNA) dizilimi uygulandı . Ağırlıklandırılmamış UniFrac'a dayalı temel koordinat analizi (PCoA), diyetlerin bağımsız olarak kümelendiğini gösterdi ( Şekil 4C ). Simpson'ın çeşitlilik indeksi ile ölçüldüğü üzere çekal mikrobiyotanın alfa çeşitliliği, ısıl işlem görmüş diyetle beslenen farelerde değişmedi ( Şekil 4D ). Etki boyutu ölçümleriyle birleştirilmiş doğrusal diskriminant analizini (LDA) kullanma [LEfSe ( 26)], daha sonra ısıl işlem görmüş bir diyet alan farelerde hangi taksonların zenginleştiğini belirledik ( Şekil 4, E ve F ). Özellikle, Epsilonproteobacteria, Helicobacteraceae'deki bir genişleme ( Şekil 4G ) tarafından yönlendirilen ısıl işlem görmüş diyet ( Şekil 4, E ve F ) ile zenginleştirilmiştir . LDA skoru ile ölçüldüğü üzere en fazla daraltılmış özellik Saccharibacteria (önceden TM7 olarak biliniyordu) idi ( Şekil 4H ). Sıçanlarda yaptığımız çalışmalarla ( Şekil 1 ) tutarlı olarak , ısıl işlem görmüş diyet, albüminüri ( Şekil 4I ), böbrek fonksiyonunda bir değişiklik (plazma sistatin C ile gösterildiği gibi hiperfiltrasyon; Şekil 4J ) ile gösterilen bir CKD fenotipine yol açtı . , artan dolaşımdaki MCP-1 ( Şekil 4K) ve LPS ( Şekil 4L ). Sıkı bağlantı proteinleri okludin ve claudin-1'in gen ekspresyonu jejunumda aşağı regüle edildi ( Şekil 4, M ve N ) ve claudin-5 jejunumda yukarı regüle edildi ( Şekil 4O ), bu da olasılığı yükseltti. bağırsak epitel bariyeri işlenmiş gıda diyeti tarafından değiştirilebilir. Ancak bu bölgede zonula occludens-1 ( Tjp-1 ) değişmemiştir ( Şekil 4P ). İleumda , ısıl işlem görmüş diyet okludin ( Şekil 4Q ) veya zonula okludens-1 ( Şekil 4T ) gen ekspresyonunu etkilemezken , claudin-1 ve claudin-5 belirgin şekilde yukarı regüle edildi ( Şekil 4 , R ve S). Aynı sıkı bağlantı protein ekspresyonu modeli kolonda görüldü (şekil S4, A'dan D'ye). Birlikte, bu sonuçlar, bağırsak epitel bütünlüğünün işlenmiş bir gıda diyetinin aşırı tüketilmesiyle tehlikeye girebileceğini düşündürmektedir. [caption id="attachment_229516" align="alignnone" width="1400"] ŞEKİL 4 İşlenmiş diyetler, bağırsak bariyeri geçirgenliğini ve bağırsak ortak konsorsiyumunun yeniden dağıtımını destekler.( A ) Tedavi edilmemiş diyet (Con, beyaz), işlenmiş ısıl işlem görmüş diyet (HT; kırmızı) veya ısıl işlem görmüş diyet artı AGE inhibitörü ALA (HT + ALA; mavi) (10 mg) alan sıçanlarda serum LPS /kg/gün 24 hafta boyunca oral gavaj). ( B ) 24 hafta boyunca ısıl işlem görmüş (kırmızı) diyet artı veya eksi C5aR1 antagonisti PMX53 (günde 2 mg/kg oral gavaj, gri) alan sıçanlarda serum LPS. ( C ila M ) C57BL/6 fareleri, 24 hafta boyunca ya kontrol (Con; yeşil) ya da ısıl işleme tabi tutulmuş (kırmızı) diyetlerle beslendi ve çekal sindirime 16 S uygulandı.rRNA dizilimi: (C) çekum sindiriminin PCoA'sı (ağırlıksız UniFrac). Yeşil (sol altta), pişmemiş diyeti kontrol edin; kırmızı (sağ üstte), ısıl işlem görmüş işlenmiş diyet. (D) Simpson'ın çeşitliliği. (E) Kladogram ve (F) LDA skor grafiği, C57BL/6 farelerinde ısıl işlem görmüş diyet ve kontrol diyeti ile beslenenler arasında görülen mikrobiyota farklarını gösterir. (G) Göreceli Helicobacteraceae bolluğu . (H) Göreceli Saccharibacteria bolluğu. Isıl işlem görmüş diyetle beslenen C57BL/6 fare: (I) 24 saatlik idrarla albümin atılımı. (J) Plazma sistatin C. (K) Plazma MCP-1. (L) Plazma LPS. (M) okludin , ( N ) claudin-1, ( O ) claudin-5 ve ( P ) zonula occludens-1 ( Tjp-1 )'in jejunum ifadesi . ileum ifadesi ( Q) okludin , ( R ) claudin-1, ( S ) claudin-5 ve ( T ) zonula oklüdens-1 ( Tjp-1 ). Veriler, ortalama ± SEM olarak görüntülenir. Noktalar bireysel kemirgenleri temsil eder. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 ve **** P < 0.0001. P değerleri, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi (A ve ? ile tek yönlü ANOVA ile belirlendi, n = grup başına 10 sıçan; iki kuyruklu eşleştirilmemiş Mann-Whitney U testi (D ve G'den M'ye), n = mikrobiyom analizi için grup başına 4 ila 6 fare; n = diğer analizler için grup başına 7 ila 12 fare[/caption] . Isıl işlem görmüş bir diyet yemenin bir sonucu olarak tamamlayıcının bağırsak seviyesinde yukarı regüle edilip edilmediğini belirlemek için kompleman C3 ve C5'in bağırsak ekspresyonu belirlendi. C3, ısıl işlem görmüş bir diyetle beslenen farelerin ileum (şekil S5A) ve jejenum'unda (şekil S5B) değişmedi ve C5 ekspresyonu saptanamadı (şekil S5), bu da komplemanın bağırsağın distalinde aktive olduğu hipotezini desteklemektedir (örn. , dolaşım içinde). Bu, AGE'lere maruz bırakılan Caco-2 hücrelerinin kullanıldığı in vitro çalışmalarla doğrulandı. Caco-2 hücrelerinin AGE'lerle 24 saat kuluçkalanması, sıkı bağlantı proteini JAMA'nın ekspresyonunda bir artışa yol açtı (şekil S6A), ancak hücresel tamamlayıcıda (C3, C5 ve C5aR1) hiçbir değişiklik gözlenmedi (şekil S6 , B'den D'ye). AGE maruziyetinden sonra inkübasyon ortamına C5a salınımında herhangi bir değişiklik olmadı (şekil S6E). . İşlenmiş bir diyetin tüketilmesi, bağırsak bariyeri geçirgenliği yoluyla mikrovasküler hastalık riskini artırır. İşlenmiş diyetlerin bağırsak epitel bariyeri ve mikrovasküler hastalık riski üzerindeki etkilerini daha fazla araştırmak için, CKD gelişimine duyarlı bir model olan spontan diyabetik leptin reseptörü eksikliği ( Lepr db/db ) fare üzerinde çalışılmıştır. Maruz kalma Lepr , db / db kıyasla daha albüminüri yol 10 hafta boyunca ısıl işleme tabi tutulmuş “işlenmiş” diyet farelerin Lepr db / db bir pişmemiş kemirgen yemi (alıcı farelerde Şek. 5A ). GFR, vekil ölçüm kreatinin klirensi ile gösterildiği gibi , ısıl işlem görmüş diyeti yiyen diyabetik olmayan db/m farelerde yükselmiş , hiperfiltrasyona işaret etmiş ve Lepr db/ db'de azalmıştır.fareler, tipik olarak böbrek hastalığı daha ileri bir aşamaya ilerledikçe ortaya çıkan ısıl işlem görmüş diyetle beslenmiştir ( Şekil 5B ). Gelen Lepr db / db farelerinde, bağırsak gergin junksiyon bütünlüğü epitelyal bariyer (boyunca lümen moleküllerinin artmış akışı ile tatlıya Şek. 5C ). On haftalık işlenmiş bir diyetle beslenme, diyabet durumunda bağırsak bariyer fonksiyonunu daha da bozdu ( Şekil 5C ). Bu sonuçlar, işlenmiş diyetlerin bağırsak bariyeri işlev bozukluğunu ve mikrovasküler hastalık riskini artırabileceğine dair ikna edici kanıtlar sunmaktadır. . Yüksek lifli, dirençli nişasta diyeti, bağırsak bariyer fonksiyonunun bozulmasını önler ve komplemanın baskılanması yoluyla böbrek hasarının şiddetini iyileştirir. Diyet lifi uzun zamandır gastrointestinal inflamatuar bozukluklarda faydalı etkiler ve kolon kanserinden korunma ile bağlantılıdır ( 27 ); bununla birlikte, diyet lifinin bağırsak dışındaki iltihaplanma üzerinde sonuçları olduğuna ve bağırsağın distalindeki organlarda sağlığı geliştirici özelliklere sahip olabileceğine dair artan sayıda kanıt vardır ( 28 , 29 ). Dirençli nişasta, ince bağırsakta sindirime dirençli olan ve kolon bakterileri tarafından fermente edildiği kalın bağırsağa geçen prebiyotik bir liftir. Buna göre, Lepr db/ db'deki bağırsak mikrobiyomunu hedeflemek için yüksek amilozlu mısır nişastası tip 2 (HAMS-R2) formunda dirençli nişasta takviyesi kullandık.fare modeli. Dirençli nişasta takviyeli diyet, ısıl işlem görmüş diyetle beslenen Lepr db/db farelerinde albüminüriyi tersine çevirdi ( Şekil 5A , turuncu çubuklar), ancak kreatinin klirensini etkilemedi ( Şekil 5B ). Fibrozun önemli bir belirteci olan fibronektin, Lepr db/db farelerinin böbreğinde arttırıldı ve ısıl işlem görmüş diyet tüketimi ile daha da yukarı regüle edildi ve dirençli nişasta ile normalleştirildi ( Şekil 5D ). . Daha sonra, prebiyotik tüketimine yanıt olarak glikoz kullanımını değerlendirmeye çalıştık. Bu tespit Lepr db / db dirençli nişasta ek İnsülin Direnç (HOMA-IR homeostatik modeli Değerlendirilmesi hiçbir değişiklik çevrilmiş kan glikoz (şek. S1) veya plazma insülin (şek. S1 oruç hiçbir değişiklik vardı alıcı farelerin ) (şekil S1C). Oral glukoz yüklemesine [oral glukoz tolerans testi (OGTT)] yanıt olarak, diyabetik grupta dirençli nişasta görülmesiyle birlikte kan glukozunda (şekil S1D) veya plazma insülininde (şekil S1E) herhangi bir değişiklik olmadı ( Lepr db/ db ). Benzer şekilde, diyabetli farelerde ( Lepr db/db ), dirençli nişasta tüketimi ile uzun süreli glikoz kontrolünde (GHb; şekil S1F), yağ kütlesinde (şekil S1G) veya yağsız kütlede (şekil S1H) herhangi bir değişiklik olmadı. Daha sonra tüm vücut oksijen tüketimini (şekil S1I), solunum hızını (şekil S1J) ve fiziksel aktiviteyi (şekil S1K) belirledik ve diyabet oluşumunda bir azalma olsa da dirençli nişastanın etkilenmediğini bulduk. bu parametreler. Bu veriler, dirençli nişasta takviyesinin böbrek koruyucu etkisinin, vücut bileşimindeki veya glisemik kontroldeki değişikliklerden bağımsız olarak meydana geldiğini göstermektedir. . Lepr db/db faresinde ( Şekil 5 ) daha önceki çalışmalarımız , işlenmiş diyetin bağırsak geçirgenliğinde bir artışa yol açtığını ortaya koydu. Tüm Lepr db / db ısı ile muamele edilmiş diyet alan farelerin dirençli nişasta ile takviye edilmiş plazma (dekstran-floresin izotiyosiyanat (FITC) ile görünüm ile gösterildiği gibi, bağırsak gergin junksiyon bütünlüğü kontrol diyetine kıyasla değişmemiştir Şek. 5C ). İşlenmiş diyetin Lepr db/db farelerinde çekum mikrobiyomunu etkileyip etkilemediğini belirlemek için , 16 SÇekal sindirimden ekstrakte edilen DNA'nın rRNA dizilimi yapıldı ve veriler, diyabet ortamında ısıl işlem görmüş diyetin tüketilmesinin Firmicutes: Bacteroidetes oranında bir artışa yol açtığını gösterdi ( Şekil 5E ). Dirençli nişasta takviyesinin kolonda faydalı sakarolitik bütirat üreten bakteri türlerinin varlığını arttırdığı bilinmektedir. Dirençli nişasta diyeti , esas olarak Bacteroidia sınıfındaki değişiklikler tarafından yönlendirilen Firmicutes/Bacteroidetes oranındaki ( Şekil 5E ) ısıl işlem görmüş diyet kaynaklı artışı tersine çevirerek, bağırsak mikrobiyal ekolojisindeki değişiklikleri destekledi ( Şekil 5F ). Diyabetik farelerde, ısıl işlem görmüş diyet, Enterobacteriaceae bolluğunda dört kat artış ile ilişkilendirildi., daha önce dirençli nişasta takviyesi ile azaltılan CKD'li hastalarda ( 30 ) yükseldiği gözlemlenmiştir ( Şekil 5G ). Daha sonra, ısıl işlem görmüş bir diyet alan diyabetik farelerde hangi taksonların zenginleştiğini belirlemek için etki büyüklüğü ölçümleriyle [LEfSe ( 26 )] birleştirilmiş LDA kullandık . C57BL/6 farelerinde yaptığımız önceki deneyle tutarlı olarak, ısıl işlem görmüş bir diyetin Verrucomicrobia'nın zenginleşmesi ile ilişkili olduğunu, Bacteroidetes'in ise azaldığını gözlemledik ( Şekil 5, H ve I ). [caption id="attachment_229517" align="alignnone" width="1400"] ŞEKİL 5 İşlenmiş bir diyetin tüketilmesi, dirençli nişasta lifi ile iyileştirilebilen diyabetik böbrek hastalığı riskini artırır.Spontan diyabetik leptin reseptörü eksikliği olan ( Lepr db/db ) ve db/m (diyabetik olmayan kontrol) farelere pişmemiş kontrol diyeti (yeşil), ısıl işlem görmüş diyet (kırmızı) veya dirençli nişasta ile desteklenmiş ısıl işlem görmüş diyet verildi. (yüksek amilozlu mısır nişastası) (HT + RS; portakal) 10 hafta süreyle ve böbrek fonksiyonu, bağırsak geçirgenliği ve bağırsak mikrobiyal ekolojisi belirlendi. ( A ) Albüminin yirmi dört saatlik idrarla atılımı. ( B ) Kreatinin klirensi. ( C ) İn vivo bağırsak geçirgenliği. ( D ) Böbrek fibronektin ekspresyonu. ( E için I ) çekal digesta hastaya 16 SrRNA dizilimi: (E) Firmicutes/Bacteroidetes oranı. (F) Göreceli Bacteroidia bolluğu. (G) Göreceli Enterobacteriaceae bolluğu . (H) Kladogram ve (I) LDA skor grafiği, ısıl işlem görmüş diyetle beslenenler ile kontrol diyeti alanlar arasında diyabetik farelerde görülen mikrobiyota farklarını gösterir. Veriler ortalama ± SEM'dir. Noktalar bireysel kemirgenleri temsil eder. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 ve **** P < 0.0001. P değerleri, Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü ANOVA ile belirlendi, grup başına n = 8 ila 16 fare.[/caption] . Böbrek gibi bağırsağa uzak organlarda beslenme, bağırsak mikrobiyotası ve gen düzenleme yolları arasındaki etkileşimleri tanımlamaya yoğun bir ilgi vardır. Diyabet ortamında işlenmiş gıda kaynaklı böbrek hasarına ilişkin mekanik anlayış sağlamak için, kontrol diyeti, ısıl işlem görmüş diyet ve dirençli nişasta ile desteklenmiş ısıl işlem görmüş diyet almış diyabetik farelerin böbreklerinin transkriptomiklerini gerçekleştirdik ( n = grup başına 5). Gen yollarının hiyerarşik kümelenmesini gösteren bir ısı haritası Şekil 6A'da gösterilmektedir . Dirençli nişasta takviyesi , Şekil 6B'de gösterildiği gibi, Lepr db/db farelerinde ısıl işlem görmüş diyetlerle gözlemlenen gen değişikliklerini tersine çevirdi .. Reactome gen seti zenginleştirme analizi (GSEA), ısıl işleme tabi tutulmuş diyet nedeniyle bağışıklık sinyal yollarının yukarı regülasyonunu ve ardından dirençli nişasta takviyesi ile aşağı regülasyonu ( Şekil 6C ), en belirgin olarak sitokinler ve sınıf A1 rodopsin benzeri reseptörler yoluyla sinyalleşme gösterdi. ve GPCR (G protein-bağlı reseptör) ligand bağlanması. Daha kapsamlı MSigDB veri tabanı kullanılarak yapılan daha fazla analiz, ısıl işlem görmüş bir diyetle beslenen Lepr db/db farelerinde nükleer faktör κB (NF-κB) yoluyla tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) sinyalinin yukarı regüle edildiğini gösterdi [farelerle karşılaştırıldığında bir kontrol diyeti ile beslendi, normalleştirilmiş zenginleştirme puanı (NES) = 5,97, yanlış keşif oranı (FDR) < 0,001; Şekil 6D] ve dirençli nişasta ile desteklenmiş ısıl işlem görmüş bir diyet alan farelerde aşağı regüle edilmiştir (ısı ile işlem görmüş bir diyetle beslenen farelere kıyasla, NES = -5.98, FDR < 0.001; Şekil 6E ). Kayda değer ve daha önceki in vivo deneysel modellerimizle tutarlı olarak, ısıl işlem görmüş bir diyet, kompleman kaskadında yer alan genlerin yukarı regülasyonu ile ilişkilendirildi ( Şekil 6F ). Bu yolun sorgulanması, Lepr db/db farelerinin diyabetik olmayan farelere kıyasla kompleman C5a'da bir artışa sahip olduğunu gösterdi , bu da dirençli nişasta takviyesi ile açıkça bastırıldı ( Şekil 6G).). Bu bulgular, diyabet bağlamında, ısıl işlem görmüş diyetlerin, lif takviyesi ile zayıflatılabilen tamamlayıcı dahil olmak üzere lokal renal inflamatuar yolların yukarı regülasyonu ile bağırsak geçirgenliğini ve böbrek hasarını tetiklediğini göstermektedir. . Enflamasyonun böbreğe lokalize olup olmadığını araştırmak için karaciğeri alternatif bir enflamasyon bölgesi olarak araştırdık. İnflamatuar sitokinler ve kemokinler için karaciğer mRNA'ları, ısıl işlem görmüş diyetle değişmedi (şekil S7). . Isıl işlem görmüş diyetler, amino asit metabolit yollarının yukarı regülasyonu ile çekal metabolomunu değiştirir Bu çalışmalar, işlenmiş gıdaların kronik tüketiminin gastrointestinal ekosistemdeki değişiklikler yoluyla böbrek sağlığını olumsuz etkilediği fikrini desteklemektedir. Bağırsak mikrobiyotası tarafından alt gastrointestinal sisteme ulaşan kompleks karbonhidratların, proteinlerin ve yağların fermantasyonu, hem lokal hem de sistemik olarak hareket edebilen çok sayıda metabolitin sentezi ile sonuçlanır ve proteinlerin konakçı tarafından sindirilebilirliği kısmen etkilenir, gıda işleme yoluyla ( 31). Bu sinyallerin inflamasyon ve böbrek hasarının ortaya çıkmasından sorumlu olabilecek bilinen toksik metabolitleri temsil edip etmediğini belirlemek amacıyla ısıl işlem görmüş diyet şekilli bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen metabolitleri belirlemeye başladık. Böylece, bu görüşle fare çekal metabolomunu araştırdık. Denetimli bir model kullanarak, kontrol (ısıl işlem görmemiş), ısıl işlem görmüş ve ısıl işlem görmüş artı dirençli nişasta diyetleri arasında, özellikle ısıl işlem görmüş artı dirençli nişasta diyetinin, ısıl işlem görmemiş diyetin yakınında kümelenmesiyle, farklılıklar gözlemledik. , ve açık bir ısıl işlem görmüş diyet metabolomunun ortaya çıkması (şekil S2A). Isıl işlem görmüş diyet, fenilalanin, triptofan ve tirozin yollarındaki metabolitlerde bir artışla ilişkilendirildi (şekil S2B) ve ısıl işlem görmüş bir diyete dirençli nişasta eklendiğinde, bu yollardan geçen metabolik akış azaltıldı (şekil S2C). Korelasyon analizi, bu metabolitler ve Firmicutes filumları arasında pozitif bir korelasyon gösterirken, Bacteroidetes (burada daha önce ısıl işlem görmüş bir diyetle azaltıldığı gösterilmiştir) negatif korelasyon gösterdi (şekil S3). [caption id="attachment_229521" align="alignnone" width="1400"] ŞEKİL 6 Diyabetik farelerde dirençli nişasta, böbrekteki bağışıklık ve iltihaplanma yollarını tersine çevirir.Lepr db/db (diyabetik) ve db/m (kontrol) fareler pişmemiş kontrol diyeti (yeşil), ısıl işlem görmüş diyet (kırmızı) veya dirençli nişasta (yüksek amilozlu mısır nişastası) ile desteklenmiş ısıl işlem görmüş diyetle beslendi. , turuncu) 10 hafta boyunca uygulandı ve böbreğin transkriptomik (RNA dizilimi) yapıldı. ( A ) Gen yolunun (MSigDB'den) ekspresyon modellerinin hiyerarşik kümelenmesini gösteren ısı haritası. ( B ) Diyabetik farelerde diyete bağlı olarak ekspresyon farklılıklarının sıra-sıra grafiği. Sağ altta, ısıl işlem görmüş diyette yukarı regüle edilmiş ve dirençli nişasta tarafından tersine çevrilmiş bir gen kümesi (kırmızı) görülmektedir. Sol üst küme, ısıl işlem görmüş diyetle aşağı regüle edilen ve dirençli nişasta tarafından yukarı regüle edilen genleri gösterir. ( C) Reactome yolu analizi, Lepr db/db farelerinde (FDR < 0.05) ısıl işlem görmüş diyetle besleme ile birkaç bağışıklık sinyal yolunun yukarı ve dirençli nişasta tarafından aşağı regüle edildiğini gösterir . ( D ) Isıl işlem görmüş diyet (NES = 5.97, FDR < 0.001) ile NF-KB yoluyla TNF-a sinyalinin yukarı regülasyonunu gösteren GSEA grafiği. ( E ) Dirençli nişasta takviyesi ile NF-κB yoluyla TNF-a sinyallemesinin aşağı regülasyonunu gösteren GSEA grafiği (NES: -5.98, FDR < 0.001). ( F ) Isıl işleme tabi tutulmuş diyetle besleme ile kompleman kaskadında yer alan genlerin yukarı regülasyonunu gösteren GSEA grafiği. ( G ) Yirmi dört saatlik idrarda C5a atılımı. Veriler ortalama ± SEM'dir. Noktalar bireysel kemirgenleri temsil eder. * P< 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 ve **** P < 0.0001. P değerleri, Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi (G) ile iki yönlü ANOVA ile belirlendi, üriner C5a analizi için grup başına n = 8 ila 11 fare, renal transkriptom analizi için grup başına n = 5 fare.[/caption] . Bakteriyel metabolitlerin doğrudan kompleman aktivasyonunu destekleyip desteklemediğini belirlemek için Caco-2 hücreleri, ısıl işlem görmüş diyet tarafından yukarı regüle edildiği gösterilen iki anahtar metabolite maruz bırakıldı: tiramin (Tyr) ve 3-hidroksifenilasetik asit (3-HPA). Caco-2 hücrelerinin Tyr ve 3-HPA ile inkübasyonu, C3 ve C5 ekspresyonunu yukarı regüle etti (şekil S8, A'dan D'ye), bakteriyel metabolitlerin komplemanı aktive edebileceğini ve diyet AGE'leri ile kompleman aracılı arasında bir bağlantı sağlayabileceğini gösterdi. böbrek hasarı. . TARTIŞMA Yağ, şeker ve tuz açısından zengin işlenmiş gıdalardan oluşan modern Batı diyetinin, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı gibi çok çeşitli uç organ patolojilerini de gösteren obezite krizine önemli ölçüde katkıda bulunduğu giderek daha belirgin hale geldi. belirli kanser türleri, tip 2 diyabet ve ilgili makro ve mikrovasküler hastalıklar ( 32 , 33). Gelişmiş ülke nüfusunun önemli bir bölümünün yaşam tarzı, kahvaltılık gevrekler, bisküviler ve yüksek derecede ısıl işlem görmüş atıştırmalık yiyecekler gibi yüksek miktarda tüketime hazır gıda alımı ile karakterize edilir. Gıda işleme değiştirir bu sayede kimyasal gıda maddelerinin yapısı ve, içsel olarak lezzet iyileştirilmesi ve potansiyel olarak (aşırı yeme yol açan, beyin ödül merkezleri uyarıcı, raf ömrü, lezzete ve duyusal özelliklerini arttırır 34 - 36 ). Üreticiler, sağlıklı beslenme yönergelerini karşılamak için bu ürünlerin yağ, şeker ve tuz içeriğini sınırlamaya çalışsa da, bu gıdalar genellikle zengin AGE kaynaklarıdır. Burada, işlenmiş gıdaların AGE bileşeninin mikrovasküler hastalık riskinin bir aracısı olduğunu belirledik. . Çalışmalarımız, ısıl işlem görmüş diyetlere kronik maruz kalmanın, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar bir bileşeni olan kompleman sistemini hiperaktive ettiğini ve proinflamatuar kompleman son efektör molekülleri C3a ve C5a'nın, bir CKD fenotipi ile tutarlı olan böbrek hasarına yol açtığını göstermiştir. Daha önce AGE'lerin ve onların öncüllerinin CKD'nin patogenezine katkıda bulunduğu varsayılmıştı, ancak mekanizmalar büyük ölçüde GFR'de bir düşüş sırasında plazmada biriken ve AGE öncüsü metilglioksal ve onun endojen detoksifikasyon sistemini içeren endojen oluşum yollarına odaklanmıştı. , glioksalaz sistemi ( 37). Burada, ısıl işlem görmüş, işlenmiş gıda diyetinin bir parçası olarak tüketilen AGE'lerin bağırsak geçirgenliğini arttırdığı ve sistemik doğuştan gelen immün kompleman aktivasyonunu indüklediği, inflamasyonu ve böbrek hasarını tetiklediği alternatif bir mekanizma tanımlıyoruz. AGE yolunun alagebrium ile inhibisyonu, böbrek hasarı fenotipini tersine çevirir ve işlenmiş bir diyet nedeniyle kompleman aktivasyonunu azaltır. Oral olarak aktif bir C5aR1 inhibitörü kullanılarak C5a sinyalinin spesifik blokajı böbrek hasarını önlerken, C3aR'nin genetik olarak silinmesi sadece kısmi renoproteksiyona yol açar. C5a'nın blokajının C3a'dan daha etkili olması muhtemeldir, çünkü C5a, kompleman yolunun en güçlü proinflamatuar efektör molekülüdür ve C3a'dan 50 ila 100 kat daha güçlüdür ( 38).). C3a ayrıca, farklı koşullar altında inflamatuar veya anti-inflamatuar eylemler sergileyen ikili bir rol oynar ( 39 ). . Düşük fakat kalıcı sistemik inflamasyon düzeylerinin kronik hastalık gelişiminin altında yatan ortak özellikler olduğu konusunda bir fikir birliği vardır ( 40 ), inflamasyonun itici gücü olarak diyete daha yakın bir ilgi vardır ( 41).). Mevcut çalışmalarda, işlenmiş diyetlerin in vivo olarak kompleman aktivasyonunun yukarısında meydana gelen bağırsak geçirgenliğini değiştirdiğini gözlemledik. Kompleman, ısıl işlem görmüş bir diyet yemenin bir sonucu olarak bağırsak seviyesinde yukarı regüle edilmedi, bu da komplemanın bağırsağın distalinde (yani dolaşım içinde) aktive olduğu hipotezini desteklemektedir. Bu, hiçbir tamamlayıcı aktivasyonunun görülmediği AGE'lere maruz kalan Caco-2 hücrelerinin kullanıldığı in vitro çalışmalarla doğrulandı. Kan dolaşımındaki aktive edilmiş bir kompleman kaskadı, böbrek üzerindeki reseptörü C5aR1'e bağlanabilen ve enflamasyon ve fibrozise neden olan ve böbrek hasarı ile sonuçlanan efektör molekül C5a'nın üretimine yol açar. . Bir fare diyabet modelinde, yüksek dirençli bir nişasta lifi diyeti, bağırsak kommensal konsorsiyumunun yeniden dağılımına yol açtı, bozulmuş bağırsak bariyer fonksiyonunu önledi ve komplemanın baskılanması yoluyla böbrek hasarının şiddetini azalttı. Bu deneysel bulgular, artan diyet lifi alımının KBH'li hastalarda tüm nedenlere bağlı mortaliteyi azalttığını gösteren epidemiyolojik çalışmalardan elde edilen verilerle tutarlıdır ( 42 ). Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, işlenmiş gıdaların iltihaplanma ve kronik hastalık riski üzerindeki rolüne dair mekanik bir bakış açısının yanı sıra, yüksek oranda işlenmiş diyetlerin aşırı tüketiminden kaynaklanan hasarın hafifletilebileceği pratik bir yol sağlar. Sağlıklı bir popülasyondaki bireylerin yaklaşık %30'unun teşhis edilmemiş hafif böbrek yetmezliğine sahip olabileceği göz önüne alındığında ( 43), termal olarak işlenmiş gıdaların aşırı tüketimi hastalık riski oluşturabilir veya önceden var olan patolojiyi şiddetlendirebilir. . Bu çalışmanın çeşitli sınırlamaları mevcuttur. Bu çalışmanın bir sınırlaması, kompleman yolu aktivasyonundan ve böbrek hasarından sorumlu spesifik AGE parçasını belirlemeye çalışabilecek indirgemeci bir yaklaşımın olmamasıdır. Gelecekteki çalışmalar, diyetlerle zenginleştirilmiş veya KML gibi oral gavaj yoluyla verilen bireysel AGE'leri içerebilir. Bununla birlikte, işlenmiş gıda maddelerinde birden fazla AGE parçası bulunması muhtemel olduğundan, mevcut çalışma, ısıl işlem görmüş bütün bir gıda matrisi sağlayarak “gerçek dünya” yaklaşımını yakalamak için tasarlanmıştır. Ek olarak, mevcut çalışmanın kapsamı dışında olmasına rağmen, gelecekteki çalışmalar (i) AGE'lerin bağırsak epitelyal bariyerini bozduğu mekanizmayı tanımlamaya, (ii) bakteriyel metabolitlerin sistemik dolaşım içinde kompleman aktivasyonunu indükleyip tetiklemediğini belirlemeye, Birlikte, işlenmiş gıdaların kronik tüketiminin, bağırsak bariyeri geçirgenliğini ve kompleman yolu aktivasyonunu indüklediğine ve kemirgenlerde mikrovasküler hastalık riski oluşturduğuna dair kanıtlar sunuyoruz. Proinflamatuar C5a-C5aR1 ekseninin farmakolojik inhibisyonu, işlenmiş gıda alımının zararlı etkilerini önler. Son olarak, bağırsak hedefli bir diyet müdahalesinin modern, işlenmiş diyetin olumsuz etkisini sınırladığını ve gıda ürünlerinin sağlık sonuçlarını sınırlamak için daha iyi formüle edilmesi için pratik bir yol sağladığını gösteriyoruz. . MALZEMELER VE YÖNTEMLER Deneysel tasarım Hayvanlar Tüm hayvan deneyleri, Alfred Tıbbi Araştırma ve Eğitim Bölgesi (AMREP) Hayvan Etik Komitesi ve Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi'nin yönergelerine uygun olarak yapıldı. Tüm kemirgenler, 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü ve yemek (Specialty Feeds, Perth, WA, Avustralya) ve suya ad libitum erişimi olan, sıcaklık kontrollü bir ortamda barındırıldı. Erkek Sprague-Dawley sıçanları, Animal Resources Centre, Perth, Batı Avustralya, Avustralya'dan satın alındı. C57BL/6J genetik arka planı (>12-nesil geri çaprazlama) üzerinde C3aR +/+ (yabani tip) ve C3aR -/− fareleri ( 44 ) Queensland Üniversitesi Biyolojik Kaynaklar Hayvan Tesislerinde spesifik patojen içermeyen koşullar altında tutuldu. . C3aR −/− fare ve sıçan çalışmaları için, 6 haftalık hayvanlara 24 hafta boyunca ya ısıtılmamış kontrol diyeti (pişmemiş AIN93G) ya da termal olarak işlenmiş bir diyet (160°C'de 1 saat fırınlanmış AIN93G; aşağıya bakınız) verildi. ad libitum. Termal olarak işlenmiş diyetler almaya ek olarak, ikinci bir sıçan grubu, oral gavaj yoluyla ALA (günde 10 mg/kg) almak üzere randomize edildi. Üçüncü bir sıçan kohortu, günlük PMX-53 (günde 2 mg/kg) oral gavaj ile termal olarak tedavi edilen diyeti aldı. . Diyabet çalışması için, Lepr geninin silinmesi için 4 haftalık erkek db/m ve Lepr db/db fareleri heterozigot ve homozigot ( BKS.Cg- Dock7 m +/+ Lepr db/J), The Jackson Laboratory'den (Bar Harbor, ME) satın alındı ​​ve 6 ila 7 haftalıkken diyet müdahalelerinden önce 2 hafta boyunca ortama alışmaya bırakıldı. Diyetler 10 hafta boyunca ad libitum olarak verildi. Diyabet çalışmasının son noktasında (8. hafta), yağ kütlesi ve yağsız vücut kütlesi, 4'ü 1 arada EchoMRI vücut kompozisyonu analizörü (Columbus Instruments, ABD) kullanılarak belirlendi. Ek olarak, fareler oksijen tüketimi, solunum hızı ve fiziksel aktivite ölçümü için 24 saat boyunca kapsamlı bir laboratuvar hayvanı izleme sistemine (CLMS, OxyMax, ABD) yerleştirildi. . Sıçan çalışmalarının 24. haftasında ve C3aR −/− fare çalışmasının ve Lepr db/db çalışmasının 9. haftasında , hayvanlar idrar toplama için 24 saat metabolik kafeslerde (Iffa Credo, L'Arbresle, Fransa) barındırıldı. ve yiyecek ve su alımının ölçülmesi. . Müdahale süresinin sonunda, hayvanlara intraperitoneal sodyum pentobarbiton enjeksiyonu (sıçan, 50 mg/kg vücut ağırlığı; fare, 100 mg/kg vücut ağırlığı; Euuthal; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Avustralya) ile anestezi uygulandı, ardından hayvanlara anestezi uygulandı. kardiyak kan kaybı ile. Kan sodyum sitrat (%3.2 v/v) ile işlendi ve 6000 rpm'de 6 dakika santrifüjlendi ve plazma kuru buz üzerinde donduruldu ve -80°C'de saklandı. Sıçan çalışmaları için, abdominal aorta, dolaşımdaki kanı çıkarmak için 1 ila 2 dakika 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüze edildi ve böbrekler çıkarıldı, enine dilimlendi ve ya sıvı nitrojen içinde donduruldu ve -80°C'de saklandı. veya nötr tamponlu formalin (%10 v/v) içinde gece boyunca sonradan sabitlendi. Bağırsak kesitleri (ileum ve jejunum) da sıvı nitrojen içinde aniden donduruldu ve -80°C'de saklandı. Fare çalışmaları için, böbrek kesitleri nötr tamponlu formalin (%10 v/v) içinde sabitlendi. RNA ve protein analizi için toplanan böbrek kesitleri sıvı nitrojen içinde donduruldu ve -80°C'de saklandı. Çekal içerikler toplandı, sıvı nitrojen içinde donduruldu ve -80°C'de saklandı. . Kemirgen diyetleri Tüm diyetler, Specialty Feeds (Batı Avustralya, Avustralya) tarafından üretilen yarı saf formülasyonlardı. C3aR −/− fare ve sıçan çalışmaları için, hayvanlara 24 hafta ad libitum boyunca ya ısıtılmamış bir kontrol diyeti (pişmemiş AIN93G) ya da termal olarak işlenmiş bir diyet (160°C'de 1 saat boyunca AIN93G fırınlanmış; aşağıdaki yönteme bakın) verildi. Diyabet çalışması için, db/m ve Lepr db/db farelerine ya pişmemiş bir kontrol diyeti (SF15-021), bir ısıl işlem görmüş diyet (SF15-021, 1 saat boyunca 160°C'de pişirilmiş) ya da bir ısıl işlem görmüş diyet verildi. 10 hafta boyunca %25 dirençli nişasta (SF15-015) ile desteklenmiştir. SF15-021 ve SF15-015 diyetleri bu çalışma için özel olarak formüle edildi ve protein, yağ ve kalori içeriği açısından eşleştirildi. . Diyetlerin YAŞ içeriği Termal olarak işlenmiş diyetlerin AGE içeriği, birden fazla yöntem kullanılarak belirlendi. Kemirgen yeminde fruktozamin tayini için, yemek numuneleri (30 µl, 10 mg/ml) nitroblue tetrazolyum (NBT) boya [180 µl, 0.5 mM in 100 mM karbonat tamponu (pH 10.4)] ile karıştırıldı ve 37 ± 1'de inkübe edildi. °C karanlıkta. Absorbans, çok modlu bir plaka okuyucu (Thermo Fisher Scientific, ABD) kullanılarak 10 ve 15 dakikada 530 nm'de belirlendi. Fruktozamin seviyesi, 1-deoksi-1-morfolinofruktoz (1-DMF) tarafından oluşturulan standart eğriden hesaplandı ve µmol 1-DMF/g olarak ifade edildi. Proteine ​​bağlı CML, CEL ve metilglioksal türevli hidroimidazolon-1 (MG-H1), daha önce tarif edildiği gibi MS tarafından kemirgen yeminde belirlendi ( 45). Kısaca, toz haline getirilmiş yem numuneleri (20 mg) borat tamponu [0.2 M (pH 9.2), 200 ul] sodyum borohidrit (40 ul, 0.1 M sodyum hidroksit içinde 1 M) ile karıştırıldı. İndirgemeden sonra protein, trikloroasetik asit (%20) kullanılarak çökeltildi ve hidroklorik asit (6 M) içinde 100 ± 1°C'de 24 saat hidrolize edildi. Numuneler nitrojen altında kurutuldu, %1 trifloroasetik içinde yeniden oluşturuldu ve katı faz ekstraksiyonundan önce dahili standart ile eklendi. Katı faz ekstraksiyonu için Sep-Pak (RP C18 ) kolonları kullanıldı ve numune trifloroasetik asit (%20 h/h metanol içinde %1 v/v) ile yıkandı. Numuneler nitrojen altında kurutuldu ve enjeksiyondan önce 1 ml metanol (%20 h/h) içinde yeniden oluşturuldu. CML, CEL ve MG-H1 analizi, bir Sciex QTRAP 6500 + kullanılarak yapıldısıvı kromatografi-kütle spektrometresi (Sciex, Framingham, MA, ABD) ve elektrosprey iyonizasyon (ESI)-pozitif çoklu reaksiyon izleme (MRM) modunda tespit edildi. Türevler bir ters fazlı C 18 kolonu (Phenomenex Synergi Hydro-RP; 4-um partikül boyutu, 80-A gözenek boyutu, 150 mm x 4.6 mm; Phenomenex, Torrance, CA, ABD) üzerinde 0.1 doğrusal gradyanla ayrıldı. % formik asit (FA) ve asetonitril. Numune enjeksiyonu, 6 dakikada 0.4 ml/dk'lık bir akış hızıyla 1 µl idi. Kullanılan MRM geçişleri (147.4> 83.9) Lys CML (> 84 205.1), CEL (> 130 219.2), MG-H1 (> 116.1 229.2) idi [ 2 , H 2 ] -Lys (151.2> 87.9), [ 2 H 2 ] -CML (207.1> 129.9) [ 4 , H 2]-CEL (222.9>134.2) ve [3H2]-MG-H1 (232,2>116.1). Konsantrasyona (miktar oranı) ve nmol/g numune veya mmol/mol Lys olarak ifade edilen değerlere karşı dahili standart tepe alanına (alan oranı) bölünen analit tepe alanının bir grafiğiyle standart bir kalibrasyon eğrisi hazırlandı. . Ek olarak, CML içeriği, daha önce tarif edildiği gibi HPLC ile üç kopya halinde kemirgen yemi içinde belirlendi ( 46 ). Kemirgen yemindeki CML konsantrasyonları, numune işleme sırasında herhangi bir kaybı telafi etmek için her numunedeki proteine ​​bağlı serin (Ser) konsantrasyonlarına standardize edilmiştir. Isıya dayanıklı vitaminlerdeki herhangi bir kaybı belirlemek için, pişmemiş ve pişmiş kemirgen yemeğinin tiamin içeriği, Lactobacillus fermentum [Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) 9338] ve tiamin tahlil suyu (Difco, Detroit, MI, ABD) kullanılarak ölçüldü. . Böbrek hasarının belirlenmesi İdrar albümini, uygun şekilde farelere (E90-124A) veya sıçanlara (E110-125) özgü enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, ABD) ile belirlendi. Üriner böbrek hasarı molekülü-1 (KIM-1), sıçanlar (Bioassay Works, Ijamsville, MD) veya fare (USCN Life Sciences, Wuhan, Çin) için spesifik ELISA ile ölçüldü. Albümin atılım hızını elde etmek için albümin ve KIM-1 konsantrasyonları 24 saatlik idrar hacmi ile çarpıldı. Sıçan çalışmaları ve C3aR için -/-fare çalışması, idrar ve plazma kreatinin, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) (Agilent HP1100 sistemi, Hewlett Packard, Almanya) ile belirlendi. Diyabet çalışması için, üriner ve plazma kreatinin konsantrasyonları, bir Cobas Integra 400 Plus otoanalizöründe (Roche Diagnostics) piyasada bulunan bir kreatinin test kiti (Roche Diagnostics, katalog no. 03263991190) kullanılarak ölçüldü. İdrar kreatinin, her kemirgen için idrar kreatinin konsantrasyonunun 24 saatlik idrar hacmiyle çarpılmasıyla belirlendi. Kreatinin klirensi, daha önce bildirildiği gibi, ml min -1 m -2 vücut yüzey alanı olarak ifade edilen, 24 saatlik idrar kreatinin ve plazma kreatinin konsantrasyonu arasındaki bir oran olarak tahmin edildi ( 47). Plazma sistatin C, üreticinin talimatlarına göre (BioVendor, Çek Cumhuriyeti) piyasada bulunan bir kit kullanılarak belirlendi. . Böbrek histopatolojisi GSI, yarı niceliksel bir yöntemle kör bir şekilde değerlendirildi. Parafine gömülmüş sol böbrek kesildi (3 um) ve periyodik asit-Schiff (PAS) reaktifi ile boyandı. Kesitler, ışık mikroskobu altında (Analysis Imaging System, AIS, Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Kanada) ×400 büyütmede gözlendi. Kesit başına yirmi glomerül, mesanjiyal matriks genişlemesi ve/veya fokal adezyonlu hyalinosis, gerçek glomerüler tutam oklüzyonu, skleroz ve kapiller dilatasyon dahil olmak üzere glomerüler hasarın ciddiyetine göre derecelendirildi. Her glomerüldeki skleroz derecesi subjektif olarak 0 ila 4 arasında derecelendirildi: derece 0, normal; derece 1, %25'e kadar sklerotik alan (minimum); derece 2, sklerotik alan %26 ila %50 (orta); derece 3, sklerotik alan %51 ila 75; ve 4. derece, sklerotik alan %76 ila %100 (şiddetli).n 1) + (2 × n 2) + (3 × n 3) + (4 × n 4)/( n 0 + n 1 + n 2 + n 3 + n 4), burada nx glomerüllerin sayısıdır Her bir GSI derecesi. . Tubulointerstisyel alan (TIA), parafine gömülü PAS lekeli kesitlerde x200 büyütmede nokta sayma tekniği ile kör bir şekilde değerlendirildi. Her alanda, 9 eşit aralıklı ızgara çizgisine sahip bir mercek ızgarası üzerinde 81 nokta sayıldı. Böbrek bölümü başına toplam 10 kortikomedüller alan sayıldı. O bölüm için sayılan toplam alandaki TIA yüzdesine karşılık gelen kesirli alan yüzdesi (FA), %FA = (tübülointerstisyel ızgara kesişimlerinin sayısı/toplam ızgara kesişimlerinin sayısı) formülü kullanılarak hesaplandı. . immünohistokimya C5aR proteini, bir tavşan anti-C5aR1 poliklonal antikoru (Novus Biologicals #NB100-92153) kullanılarak immünohistokimya ile formalinle sabitlenmiş parafine gömülü kesitlerde belirlendi. Sıçan böbrek parafin kesitleri mumu alınmış ve rehidre edilmiştir. Endojen peroksidazlar, %3 hidrojen peroksit/tris-tamponlu salin (TBS) ile söndürüldü, ardından Süperblok Engelleme Tamponu (Thermo Fisher Scientific, Avustralya) ile bloke edildi. Tavşan anti-C5aR1 birincil antikoru, TBS içinde 1:250 oranında seyreltildi ve kesitler gece boyunca 4°C'de inkübe edildi. Yıkandıktan sonra, kesitler biyotinlenmiş sekonder antikor (keçi anti-tavşan immünoglobulin G; Vector Laboratories, Burlingame, CA, ABD; TBS'de 1:500) ile 10 dakika ve daha sonra avidin-biotin kompleksi (ABC; Vectastain Elite ABC kiti, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, ABD) 30 dakika süreyle. C5aR boyaması DAB (3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ile görselleştirildi. Kesitler hematoksilen ile zıt boyandı, kurutuldu ve DPX'e (Fluka Chemie AG, Buchs, İsviçre) yerleştirildi. İmmünohistokimyanın miktar tayini, bilgisayar destekli dansitometri (Image-Pro Plus 6.0, Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, ABD) ile yapıldı. Renal kortikal fraksiyonasyon Renal korteks, diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla hücresel bölümlere ayrıldı. Yüz miligram böbrek korteksi, 20 mM Hepes, 1 mM EGTA, 210 mM manitol ve 70 mM sakaroz (pH 7.2) içeren bir izolasyon tamponu içinde homojenleştirildi. Renal kortikal homojenatlar , 4°C'de 10 dakika boyunca 1000 g'de santrifüjlendi . Nükleer fraksiyonu içeren pelet, tampon [10 mM Hepes, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA ve 0.1 mM EGTA (pH 7.9)] içinde yeniden süspanse edildi ve 7000 g'de 30 saniye 4°C'de santrifüjlendi . Nihai topak, tampon [20 mM Hepes, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 7.9)] içinde yeniden süspanse edildi ve süspansiyonlar, 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi, ardından 10.000 g'de santrifüjlendi.4°C'de 30 dakika. Süpernatant nükleer fraksiyonu içeriyordu. Başlangıç ​​renal kortikal homojenat dönüşünden elde edilen süpernatan, mitokondriyal pelet elde etmek için 4°C'de 20 dakika boyunca 10.000 g'de santrifüjlendi . Süpernatan, peletteki membran fraksiyonu ve süpernatandaki sitozol verecek şekilde 4°C'de 1 saat boyunca 100.000 g'de daha da santrifüjlendi . Zar topağı 100,000 tekrar% 1 Triton X-100 ihtiva eden (yukarıda açıklandığı gibi) ve bundan sonra santrifüjlenmiş yalıtım tamponu g , 4 ° C 'de 1 saat süre ile, ve üst faz membranöz fraksiyonu olarak toplandı. Toplam protein, üreticinin talimatlarına (Pierce, Rockford, IL, ABD) göre bisinkoninik asit yöntemiyle belirlendi. VEGF tayini VEGF, üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen bir kit (Quantikine Rat VEGF Immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD) kullanılarak renal kortikal sitozolik fraksiyonlarda ölçüldü. TGF- β ölçümü TGF-21, Promega TGF-21 Emax ImmunoAssay System (Promega, Madison, WI, ABD) kullanılarak renal kortikal membran fraksiyonlarında ölçüldü. Aktif TGF-21, numunelerin PBS ile 1:5 oranında seyreltilmesi ve ardından pH'ın 1 M HC1 ile 3.0'a ayarlanmasıyla ölçüldü. Örnekler oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildikten sonra 1 M NaOH ile nötralize edildi. TGF-β1, üreticinin talimatlarına göre belirlendi. nitrotirozin Nitrotirozin, üreticinin talimatlarına göre ELISA (Oxis Research, Portland, OR, ABD) ile renal kortikal mitokondriyal fraksiyonlarda belirlendi. NADH güdümlü süperoksit radikal üretimi Böbrekler hızla 118 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 1.2 mM MgSO oksijen içeren doymuş Krebs tamponu [yerleştirilmiştir eksize edildi 4 .7H 2 , O, 1.2 mM KH 2 PO 4 , 11 mM D -glükoz, 0.03 mM EDTA ve 2.5 mM CaC 2 (pH 7.4)] ve ~ 1 mm'lik parçalar halinde kesilir. Süperoksit anyon oluşum hızı, lucigenin (bis- N-metilakridinyum nitrat; Sigma Kimya Şirketi). Kısaca, 100 µl substrat [125 µM NADH (nikotinamid adenin dinükleotidinin indirgenmiş formu)] ve 100 µM rotenon (mitokondriyal kompleks I inhibitörü) taze doku dilimlerine (üç kopya halinde) ilave edildi. Plaka, 3.8 uM lucigenin eklenmeden önce luminometrede 60 dakika 37°C'de ısıtıldı. Kemilüminesans, 60 dakika boyunca her 6 dakikada bir izlendi ve bu süre boyunca integral, bağıl ışık birimleri (RLU'lar) olarak ifade edildi. Sonuçlar, 10 mg kuru doku ağırlığına norm